Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate naïve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-γ ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 μg/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Größe und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Präsentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDafür wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gewählt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinbürste (PLL-Bürste). Es wird vermutet, dass die PLL-Bürste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im Körper und eine verlängerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antikörper (aDEC205) für die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL für die Spezifität der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Trägermolekül deutlich höher erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinbürste zu übertragen. Anhand dieser polymeren Träger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Knäuels und der Bürste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschließend wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antikörpers mit PLL und anschließender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tikörpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-Bürste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizität bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL Bürsten-Konjugate keine ausgeprägte Zytotoxizität aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabhängi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringfügig erhöhte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antikörper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem „Specific Hybridization Internalization Sensor“ (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch über Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antikörper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. Lösliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit möglich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Träger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Größe, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Außerdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-Bürste übertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Präsentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antikörpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien für die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

Neonatal plasmacytoid dendritic cells at the interface of innate and adaptive immunity = Neonatale plasmazytoide dendritische Zellen - an der Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunität

Human cord blood plasmacytoid dendritic cells (PDC) react to stimulation with CPG A and CPG B with an increase in cell surface activation and maturation markers and cytokine production, similar to adult PDC. Intracellular phosphorylation in neonatal PDC did not benefit from CPG stimulation, in contrast to adult PDC. Cord blood PDC primed with CPG A, CPG B and CD40L do not promote division of autologous T cells contrary to adult PDC. Priming of neonatal PDC with CPG A or CPG B does not induce a clear bias in T helper cell response towards Th1 or Th2 while adult PDC trend towards a Th2 response.

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

The role of CYLD in dendritic cell function

Deubiquitination of NF-κB members by CYLD is crucial in controlling the magnitude and nature of cell activation. The naturally occurring CYLD splice variant, devoid of exons 7 and 8, lacks TRAF2 and NEMO binding sites. The role of this splice variant in dendritic cell (DC) function was analyzed using CYLDex7/8 mice, which lack the full-length CYLD (FL-CYLD) transcript and over-express the short splice variant (sCYLD). Bone marrow derived DCs (BMDC) from CYLDex7/8 mice display a hyper-reactive phenotype in vitro and in vivo and have a defect in establishing tolerance using DEC205-mediated antigen targeting to resting DCs. This phenotype was accompanied by an increased nuclear translocation of the IκB molecule Bcl-3, and increased degradation of cytoplasmic p105 in CYLDex7/8 BMDCs after stimulation. This suggests that in contrast to FL-CYLD, sCYLD is a positive regulator of NF-κB activity and its over-expression induces a hyper-reactive phenotype in DCs.

The role of B cells during acute and latent infections with murine cytomegalovirus and Leishmania major

This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN-γ to a level comparable to wt mice. rn

Die Isolierung und Aufreinigung der Metalloendopeptidase LysN und die Evaluierung der Spezifität der LysN E157D-Mutante und ihr Einsatz in der Proteomik und die Mechanismen der Bildung von “dendritic cell aggresome- like induced structures“ (DALIS)

Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Voraussetzung hierfür ist die Spezifität der Protease. Trypsin ist bei weitem die gebräuchlichste Protease zur massenspektrometrischen Probenvorbereitung. Allerdings bietet Trypsin keine Komplettlösung. Je nach Fragestellung und Applikation müssen weitere Proteasen eingesetzt werden, um eine komplette Sequenzabdeckung zu gewährleisten und möglichst alle posttranslationalen Modifikationen nachzuweisen, oder bestimmte Proteomklassen (z.B Phosphoproteom

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods „Apoptose“ bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle für die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion für die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung für dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abtötung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfläche charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anfälliger für Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsauslösenden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, könnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems führen. Tatsächlich konnte während der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich überraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Gedächtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schwächere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das Überleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten Überlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie führte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem höheren Überleben der Parasiten.rnZusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. Während der Infektion können sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen für Leishmanien darstellen. Dafür missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das Überleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erklären den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn

Charakterisierung verschiedener Reifungsstadien humaner dendritischer Zellen und ihr Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung

Diese Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift bezieht sich auf folgende Originalarbeiten:

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis fünfte Mensch an einer Allergie. Ausgelöst wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle über die Fc-Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen führt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN- ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN- wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert. Die potentesten antigenpräsentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Moleküle exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabhängige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung führt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Moleküle, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren für Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Moleküle in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung für die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschließlich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molekülen der intrazellulär vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen höher exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erhöhte Expression gegenüber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zunächst konnte eine morphologische Veränderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflußzytometrie anhand der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, insbesondere aber über den Marker für reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern ließ. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen näher zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erhöhte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erhöhte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des „TH1-/ TH2-neutralen“ Tetanustoxoids konnten erhöhte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Berührung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten für die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese näher zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. Für die mit LPS, dem stärkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem für die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es möglich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-β) zu verifizieren.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

Molecular characterization of the immune modulatory function of matrix metalloproteinase-7, a factor in the tumour micromilieu

Matrix metalloproteinases are the components of the tumour microenvironment which play a crucial role in tumour progression. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) is expressed in a variety of tumours and the expression is associated with an aggressive malignant phenotype and poor prognosis. A role for MMP-7 in the immune escape of tumours has been postulated, but the mechanisms are not clearly understood. The present study was focused on identifying physiological inactivators of MMP-7 and also to unravel the mechanisms involved in MMP-7 mediated immune escape. This study shows that human leukocyte elastase (HLE), secreted by polymorphonuclear leukocytes cleaves MMP-7 in the catalytic domain as revealed by N-terminal sequencing. Further analysis demonstrates that the activity of MMP-7 was drastically decreased after HLE treatment in a time and dose dependent manner. MMP-7 induces apoptosis resistance in tumour cells by cleaving CD95 and CD95L. The effect of HLE on MMP-7 mediated apoptosis resistance was analysed. In vitro stimulation of apoptosis by anti-Apo-1 (anti-CD95 antibody) and the chemotherapeutic drug doxorubicin is reduced by MMP-7. Also tumour specific cytotoxic T cells do not effectively kill tumour cells in the presence of MMP-7. This study revealed that HLE abrogates the negative effect of MMP-7 on apoptosis induced by CD95 stimulation, doxorubicin or cytotoxic T cells and restores apoptosis sensitivity of tumour cells. To gain insight into the possible immune modulatory functions of MMP-7, experiments were performed to identify new immune relevant substrates. The human T cell line, Jurkat, was selected for these studies. Hsc70 which is involved in uncoating of clathrin vesicles was found in the supernatants of the MMP-7 treated cells indicating a modulatory role of MMP-7 on endocytosis. Further studies demonstrated that MMP-7 leads to decreased clathrin staining in HEK293, HepG2, Jurkat, CD4+ T cells and dendritic cells. Results also show MMP-7 treatment increased surface expression of cytotoxic T lymphocyte associated protein-4 (CTLA-4) which accumulated due to inhibition of the clathrin mediated internalization in CD4+CD25+ cells.

Phänotypische und funktionelle Eigenschaften humaner neonataler dentritischer Zellen

Humane Neugeborene leiden an einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionskrankheiten. Die dendritischen Zellen (DC) werden für die beeinträchtigten neonatalen T-Helfer 1 (Th1) Immunantworten verantwortlich gemacht. Der Hauptaktivator der Differenzierung von Th1 Zellen ist Interleukin-12 (IL-12), ein Zytokin, welches in adulten, nicht aber in neonatalen DC vornehmlich nach Bindung der Toll-like Rezeptoren produziert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle Einfluss verschiedener TLR-Liganden auf die Initiierung neonataler Th1-Immunantworten untersucht. Einzelne TLR-Liganden induzierten die Reifung adulter DC, während die neonatalen DC erst nach simultaner Stimulierung von TLR3/TLR8 bzw. TLR4/TLR8 Reifungsmarker exprimierten. Der synergistische Effekt kombinierter TLR-Liganden zeigte sich sowohl in der adulten als auch der neonatalen Zytokinproduktion, wobei unterschiedliche Expressionsmuster für IL-1beta, IL-6, IL-8, IL-10, TNFalpha und vor allem IL-27 beobachtet wurden. Besonders IL-12p70 wurde von neonatalen DC ausschließlich nach kombinierter TLR-Stimulation produziert. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit aktivierter DC analysiert, autologe T-Zellen zu polarisieren. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass die Überstände kombiniert stimulierter neonataler DC die Interferon-gamma Produktion in neonatalen naiven T-Zellen auslösten. Und somit konnte gezeigt werden, dass neonatale DC naive T-Zellen hinsichtlich einer Th1-Immunantwort polarisieren können. Letztendlich zeigen die Ergebnisse neue Möglichkeiten auf, potente Impfstrategien für Neugeborene zu entwickeln.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Alkylantien induzierte Zytotoxizität, DNA-schadensinduzierte Reparaturkapazität und Apoptoseinduktion von Immunzellen

Monozyten und Monozyten-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs) spielen eine bedeutende Rolle im Immunsystem. Da DCs bei der Tumorabwehr mitwirken, ist es wichtig, dass Monozyten als auch DCs sich gegenüber zytotoxischen Agenzien aus der Chemotherapie wehren können. Chemotherapeutika reagieren mit der DNA, jedoch die DNA-Reparaturkapazität von Monozyten und DCs wurde noch nicht untersucht. Dazu wurde die Sensitivität in Monozyten und DCs gegenüber verschiedene genotoxische Agenzien untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Monozyten sensitiv auf methylierende Agenzien (MNNG, MMS und Temozolomid) reagieren und ein verstärktes Zellsterben und Apoptoseinduktion zeigen. Im Vergleich zu weiteren Zytostatika wie Fotemustin, Mafosfamid und Cisplatin reagierten Monozyten und DCs gleich sensitiv. Diese Ergebnisse weisen auf einen Defekt in der Reparatur von DNA-Methylierungsschäden in Monozyten hin. Da die Expression des Reparaturproteins O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase (MGMT) in Monozyten höher war als in DCs und deren Inhibierung durch O6-Benzylguanin keinen Effekt auf die Sensitivität von Monozyten hatte, wurde der Reparaturweg der Basenexzisionsreparatur untersucht. Im Vergleich zu DCs waren die Monozyten unfähig die BER durchzuführen, welche durch Einzelzellgelelektrophorese gemessen wurde. Expressionsuntersuchungen ergaben, dass in Monozyten XRCC1 und Ligase IIIα fehlen im Vergleich zu DCs, Makrophagen, hämatopoetische Stammzellen und Lymphozyten, welche diese Proteine exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen einen spezifischen DNA-Reparaturdefekt in einer bestimmten Blutzellpopulation. Durch den BER Defekt in Monozyten kann es durch methylierende Tumorwirkstoffe während einer Chemotherapie zur Depletion und zu einer abgeschwächten Immunantwort kommen.